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Y2HGold Chemically Competent Cell 酵母菌化学感受态细胞的说明...

来自 : 哔哩哔哩发布时间：2021-03-24

名称：Y2HGold Chemically Competent Cell 酵母菌化学感受态细胞

其他名称：Y2HGold酵母感受态细胞

运输温度：干冰运输

有效期：三个月

应用：酵母转化实验

保存与运输方法：

保存∶其中感受态细胞按标签注明置于-80℃保存，三个月有效。其他组分按照标签注明保存，一年有效。运输:干冰运输。

描述：

酵母双杂交系统是用于体内研究蛋白相互作用的一种非常便利的工具，常用的如GAL4为基础的双杂交系统，使用酵母转录因子GAL4来检测转录激活后的蛋白相互作用。工作原理为:一个完整的酵母转录因子GAL4由两个可以分开，功能上相互独立的结构域组成，N端有一个147个氨基酸组成的DNA结合域(DNA-BD )，C端有一个由113个氨基酸组成的转录激活域( AD)。DB可以识别并结合上游激活序列(UAS )，而AD能激活UAS下游基因进行转录，单独的BD或AD不能激活基因转录。正常情况，BD和AD不会结合，将待检测的蛋白质分别与BD和AD融合，形成诱饵融合蛋白( bait-DNA)和诱捕融合蛋白( prey-DNA )，只有当诱饵和诱捕蛋白发生相互作用，促使BD和AD的相互接近，形成完整的GAL4，从而激活报告基因的转录。

V2HGold是GAL4系统酵母双杂交用实验菌株，能直接转化质粒或与MATα型酵母菌株Y187通过接合( mating )操作进行蛋白相互作用脸证或双杂交文库筛选和构建。V2HGold-GAL4酵母双杂交系统需要两种质粒配套使用，分别为pGBKT7和pGADT7。前者筛选标志为Trp1 ，用于表达DNA-BD与诱饵蛋白（ bait )的融合蛋白;后者筛选标志为Leu ,用于表达AD与诱捕蛋白(prey )的融合蛋白。V2HGold有四个报告基因:AUR1-C ，HIS3, ADE2,MEL1，分别由三个完全异源的Gal4反应启动元件-G1 , G2,，M1操控，这三种启动子只有GAL4识别的17bp核心区相同，其余部分都不同，因此大大降低了酵母双杂交假阳性发生的概率。此外，新报告基因AUR1-C与以往的营养缺陷报告基因相比，具有更低背景，这一优势也可降低酵母双杂交假阳性发生的概率。

注意事项：

1. 最好在冰上融化感受态细胞。

2. 转化高浓度质粒可相应减少用于涂板的菌量。同时转化2-3种质粒可适当增加质粒的用量。

3. Y2HGold对高温敏感，最适生长温度为27-30℃，一旦高于31℃，生长速度和转化率都呈指数下降。

4. 菌落变粉红色并不是污染，而是酵母细胞生长中的一种常见现急。当酵母细胞在平板上培养几天，将平板内的腺嘌呤消耗殆尽，那时酵母试图通过自身代谢途径合成腺嘌呤以供利用。然而，某些菌株ADE2基因被破坏，腺嘌呤合成受阻。目ADE4 ，5 ，6，7基因均正常。由此，造成中间产物P-ribosylamino imidazole ( AIR )在细胞的积累使得菌落变为粉红色。

5. 酵母菌在缺陷培养基上生长速度比YPDA培养基慢，营养缺陷成分越多，生长越慢，以转化涂板为例:涂YPDA平板于29℃，48h培养可见直经1mm克隆;涂SD单缺平板于29℃， 48-6Oh培养可见直径1mm克隆﹔涂SD双缺平板于29C，60-80h培养可见直径1mm克隆;涂SD三缺或四缺平板于29℃，80-9Oh培养可见直径1mm克隆;

6. 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

使用方法：

1. 取100 μl冰上融化的Y2HGold化学感受态细胞，依次加入预冷的目的质粒2-5 μg , Carier DNA(95-100℃孵育5 min，快速冰浴。重复一次。) 10 μl , PEG/LiAc500μl，用枪吹打几次充分混匀，30°C水浴30 min (在15min时翻转6-8次混匀)。

2. 之后将管子放42℃水浴15 min(在7.5min时翻专6-8次混匀)。

3.5000 rpm离心40s弃上清，用400 μl ddH2O重悬沉淀，离心30s弃上清.

4.用50 μl ddH2O重悬，涂板，放入29℃培养48-96 h。